怎样降低新型冠状病毒核酸检测的假阴性？样品处理是关键
当前新型冠状病毒肺炎（以下简称“新冠肺炎”）疫情形势依旧严峻，牵动着每一个国人的心。截止到2月3日17:35，全国累计报告确诊病例17332例，疑似病例21558例，同时还有大量的密切接触者在接受医学观察。疑似病例中有部分已经表现出明显的新冠肺炎临床特征，但是病毒核酸检测结果呈阴性导致不能确诊。
病人急需治疗不能等，检测试剂盒是稀缺资源不能浪费，是什么原因导致假阴性或可疑？
有一个极容易被忽视但却很重要的因素——核酸制备前的样本处理方法。
2020年1月28日，由国家卫生健康委组织印发的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室 检测技术指南（第三版）》(以下简称《指南》)作为临床鉴别新冠肺炎的指导文件，文件中关于病毒检测及结果判断说明如下：
1、检测方法：通过实时荧光RT-pCR方法检测2019-nCoV的2个靶标（ORF1ab、N），检测结果均为阳性（双阳性）就可确诊。 如果出现单个靶标阳性的检测结果则需要重新采样，重新检测。
2、结果判断：阴性:无Ct值或Ct≥40。阳性:Ct值<37,可报告为阳性。灰度区:Ct值在37-40之间,建议重复实验,若重做结果Ct值<40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。
3、结果判定：阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；样本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如病毒变异、pCR抑制等。
可能产生假阴性的因素，《指南》中提及样本质量、收集时间、运输、保存及样本处理等。而核酸制备前的样本处理是*容易被忽略但却是*主要的一个因素。
常规的样本处理方法有：液氮研磨、珠子研磨（Sport通常使用玻璃珠）、探头超声、试剂法（裂解细胞）等。
拿到病人样本以后，现有的样本处理方法能否有效的在少量、有限的样本中提取到足量的核酸？
如果不能，那么以改善实验室的样本处理方法来提高检出率就显得尤为重要。不妨试试聚焦超声技术处理医学样本来充分释放病毒核酸以便提高病毒核酸得率。
基于聚焦超声技术的高性能样本处理方法
Covaris 自动聚焦声学技术 (Adaptive Focused Acoustics™，AFA)作用于微量珍贵样本以及难处理样本，可以有效提高核酸得率。该技术整合了非线性、高强度、会聚性声学冲击波和高级计算机控制系统。通过圆盘状传感器将声波能量聚焦在样品上，且能量强度可控，采用非接触并等温的方式进行样品的匀浆或混匀。
Adaptive Focused Acoustics，AFA
Covaris S220 高性能样本处理系统
有数据表明：对于难处理的样本，基于Covaris AFA聚焦超声技术的生物大分子制备方案，其优势不仅仅表现在得率，纯度，完整性等表面价值，更重要的是提升了下游数据价值：1，qpCR 扩增效率提高；2，文库复杂度提升，基因密集区以及GC富含区测序深度提升；3，融合基因检出提升；4，医学样本如痰液中病毒核酸有效释放；5，宏基因组样本有效破碎以便下游检出更多革兰氏阳性菌。
以呼吸道合胞病毒为例。
呼吸道合胞病毒（Human Respiratory Syncytial Virus, RSV）是一种RNA病毒，可导致发热、鼻炎、咽炎及上呼吸道感染等症状。在儿童感染患者中，RSV的病毒载量(viral loads)一般较高，因此用常规商业化的抗原检测试剂盒比较容易检出。而在老年人患者中，病毒载量要低得多，为了保证检测的准确性，则需要灵敏度更高的检测方法如RT-pCR。
在临床上，RSV检测常用的样本有鼻拭子和痰液样本，其中痰液样本由于容易获得并且未经稀释，可以得到很高的灵敏度。但由于痰液样本处理步骤复杂，难以实现高通量的管理和提取。在这篇文章中，作者比较了Covaris AFA技术处理痰液结合MNAzyme探针法与Glass beads研磨方法处理痰液结合TagMan探针法对RSV病毒提取及扩增效率的影响。
为了验证超声处理是否会影响病毒RNA提取质量，作者首先使用RT-pCR方法分别检测了等量RSV-A-GFp模式菌株经Covaris AFA超声法在1℃条件下处理60min和未经超声直接提取的产物，结果显示平均Ct值为21.28±0.08，两者没有明显差异。证明超声处理对病毒RNA的提取及检测没有负面影响。
随后，作者分别使用Covaris AFA超声法和Glass beads法平行对7个痰液样本进行核酸制备前的样本处理，其中Covaris AFA超声法处理痰液步骤如下：
1、将0.1-1g痰液样本放入14mL圆底离心管中称重；
2、加入等体积的pBS/10%DTT，使混合液*小体积不得少于2.2mL；
3、立即将样本转移至Covaris AFA样本处理系统上进行匀浆处理。
处理条件：1℃的条件下处理30s
软件参数设置：Duty Cycle:20%; Intensity:10; Cycles/burst:100
经过Covaris AFA超声法和Glass beads处理后的样本，使用病毒核酸试剂盒进行RNA提�。缓笠廊徊捎肦T-pCR方法对病毒含量进行鉴定。结果显示，与Glass beads方法相比，经Covaris AFA超声法提取的样本，检测到的Ct值明显减小(变化范围1.0 - 4.0 log)，即经Covaris AFA超声法提取的病毒RNA含量更高。尤其是在7号样品中，使用Glass beads方法提取后，检测RSV-B呈阴性，而Covaris方法提取后检测结果为阳性。（如下表）
文章结论：
1、检出率高：利用Covaris AFA超声法做样本前处理，下游提取RNA再结合MNAzyme扩增提高了对不同呼吸道样本（包括痰液）中RSV（平均2个logs）的检测。
2、通用性好：这种通用的核酸提取方法应易于适用于任何其他呼吸道病原体（病毒和/或细菌）。
3、快速高效：使用Covaris AFA技术在1℃条件下对样本进行处理可以有效避开痰液处理过程中的一些繁琐步骤。Covaris AFA超声法更快速（每个样品约30秒），且只需加入pBS/10%DTT，无需使用玻璃珠及样本过滤。
4、安全性高：Covaris AFA 技术采用非接触式处理方式，不与样品直接接触，避免交叉污染的风险。
由此可见，对于常规方法难以获得理想提取效果的样本（比如本文中的痰液样本），Covaris AFA超声处理可以充分释放医学样本中的病毒核酸，提高病毒核酸得率，从源头上提高检测灵敏度，降低假阴性概率。不仅如此，Covaris AFA超声提取稳定性强，重复性好，并且还有高通量的仪器可供选择，在需要进行标准化、规模化的样本处理时，有着非常大的优势。
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原文出处
Development of a real-time multiplex RSV detection assay for difficult respiratory samples, using ultrasone waves and MNAzyme technology
David Nauwelaersa,∗, Leen Vijgenb, Claire Atkinsonc, Alison Toddd, Anna Maria Gerettic, Marc Van Ranste, Lieven Stuyvera
