南京农大用CRISPR制备基因敲除兔和山羊
肌生成抑制蛋白（Mstn）是哺乳动物骨骼肌质量的一个保守的负调节因子。然而，在家畜中是否能够实现Mstn的精确敲除，能否被安全地用来提高产肉性能，尚未得到证实。近期，来自南京农业大学、斯坦福大学等处的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》发表题为“Generation and evaluation of Myostatin knock-out rabbits and goats using CRISpR/Cas9 system”的研究成果，该研究利用CRISpR/Cas9来制备Mstn基因敲除家兔和山羊，然后分析了它们的表型变化，对上述问题进行了探讨。
这项研究的通讯作者是南京农业大学江苏省家畜胚胎工程实验室的王锋教授和张艳丽副教授。王锋教授团队围绕山羊胚胎工程和肉羊产业化开展了一系列工作，已批量获得转基因山羊，组建了“江苏省肉羊产业工程技术研究中心”（江苏省科技厅，2012），王锋教授被聘为国家肉羊产业技术体系岗位科学家（2008）。
Mstn也被称为生长分化因子8（GDF），属于TGF-β超家族。Mstn是骨骼肌肉质量的一个负调节因子。自然突变——能抑制编码的蛋白质或抑制其数量，可导致人、羊和牛的肌肉增强。Mstn基因敲除动物，如小鼠、绵羊、�：椭砭哂蟹⒋锏募∪�。据报道，在山羊中，5′-UTR上一段5bp的缺失（TTTTA）和外显子1中一段1 bp的替代（T/A），与生长性能相关，如出生时身体的大小和出生体重。在家兔中，5′-UTR上的SNps被报道与畜体结构相关。如果能够制备出没有发育和健康问题的MSTN KO动物，将提高产肉性能，并提高肉畜禽繁殖过程的速度。
CRISpR/Cas9来源于细菌基因组的适应性免疫系统，可以直接通过短的RNAs诱导精确切割。相比于HR（同源重组）、ZFN（锌指核酸酶）和TALEN（转录激活因子样酶），CRISpR/Cas9是一种易于处理、非常特异性的、有效的和多路复用的真核基因组工程方法。它已被广泛和有效地用于动物制备，如兔子、猴子、猪和绵羊，相关研究点击：我科学家用CRISpR制备基因敲入猪；科学家培育出世界首对基因编辑猴。山羊是由于它们的肉、奶和毛皮，因而是一种重要的农场动物，目前科学家利用体细胞核移植方法（SCNT）生成了三种Mstn双等位基因KO山羊。最近利用CRISpR/Cas9系统与受精卵注射法，已有研究人员制备出了55只Mstn KO山羊。总之这些结果表明，CRISpR/Cas9可以有效地用于农场动物的精确基因打靶。
有两项研究报道称，利用SCNT产生的四只Mstn KO山羊中有两只在出生时死亡。在另一项研究中，93例新生儿山羊中有13只山羊生下来是死胎，有15只Mstn改良山羊出生，相关阅读：我科学家用CRISpR获得转基因山羊。然而，在这些山羊中，没有关于“出生时死亡的13只山羊是否包含Mstn修饰”的信息，也没有这些山羊中改性Mstn比例的信息。也没有关于15改良山羊Mstn的增长率或健康状况的信息。
这些研究也没有提出关于出生体重、生长性能或任何健康相关的问题。因为目前没有研究探讨自然突变对发育的影响，或评估精确编辑的Mstn基因突变动物的生长性能，因此，在Mstn基因敲除技术应用于提高畜牧业的产肉性能之前，应该研究Mstn KO山羊和家兔的制备和评估。这对于我们在山羊、兔子或其他家畜中研究Mstn的功能，也是非常重要的。
在这项研究中，研究人员利用CRISpR/Cas9系统制备了Mstn基因敲除（KO）家兔和山羊，然后分析其表型的变化。研究人员用两个sgRNAs靶向兔Mstn胚胎注射后，从32只新生兔中有效地制备出了24只Mstn KO兔，并发现Mstn KO兔表现出体重增加，四头肌和二头肌与整个身体的重量比显著增加。Msth KO也造成了高概率的舌头肿大现象和严重的健康问题，如死胎和早期死亡。使用相同的方法，研究人员制备了Mstn位点编辑的四只山羊。这只山羊的早期生长率超过了对照组山羊。
总之，该研究团队利用CRISpR/Cas9技术，有效地制备了Mstn KO家兔和山羊。然而，Mstn KO可导致严重的健康问题，也有可能对其他物种有相同的影响。在适用于动物繁殖过程之前，必须进一步探讨这种安全问题。
（生物通：王英）
生物通推荐原文摘要：
Generation and evaluation of Myostatin knock-out rabbits and goats using CRISpR/Cas9 system
Abstract: Myostatin (Mstn) is a conserved negative regulator of skeletal muscle mass in mammals. However, whether precise disruption of Mstn in livestock can be achieved and safely used to improve meat productivity has not been proven. We applied CRISpR/Cas9 system to generate Mstn knock-out (KO) rabbits and goats and then analyzed the changes in their phenotypes to answer this question. We efficiently generated 24 Mstn KO rabbits out of 32 newborn infants after embryo injection with two sgRNAs targeting rabbit Mstn, and found that the Mstn KO rabbits exhibited increased birthweight and a significantly increase in the weight ratios of the quadriceps and biceps muscles to the whole body. Mstn KO also caused high probability of enlarged tongue phenomenon and severe health problems such as stillbirth and early stage death. Using the same method, one out of four goats was generated with edition at Mstn locus. The early stage growth rate of this goat outperformed the control goats. In conclusion, we efficiently generated Mstn KO rabbits and goats using CRISpR/Cas9 technology. However, Mstn KO causes severe health problems and may also have the same effects on other species. This safety issue must be studied further before applied to animal reproduction processes.
